Les bases de la spectrophotométrie

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La couleur est partout dans notre quotidien. Saviez-vous que vous pouvez réellement mesurer la couleur ? Le spectrophotomètre est un outil essentiel pour les biologistes et les techniciens lors de l’analyse d’échantillons chimiques et biologiques.

Ce blog examinera les bases de la spectrophotométrie et les différentes configurations.

Lumière et couleur

 

Lumière visible

 

En termes simples, les couleurs dépendent de la lumière. Nous ne voyons pas réellement les couleurs mais plutôt ce que nous voyons comme couleur, c’est l’effet de la lumière qui brille sur un objet. Lorsque la lumière blanche brille sur un objet, il peut être réfléchi, absorbé ou transmis. Le verre transmet la majeure partie de la lumière qui entre en contact avec lui, il apparaît donc incolore. La neige reflète toute la lumière et apparaît blanche. Un tissu noir absorbe toute la lumière et apparaît ainsi noir. Un morceau de papier rouge reflète mieux la lumière rouge que les autres couleurs. La plupart des objets apparaissent colorés car leur structure chimique absorbe certaines longueurs d’onde de la lumière et en réfléchit d’autres.

Lorsque nous parlons de lumière, nous parlons généralement de lumière blanche. Une mince ligne de lumière s’appelle un rayon; un faisceau est composé de nombreux rayons de lumière. Lorsque la lumière blanche passe à travers un prisme (objet transparent triangulaire), les couleurs qui composent la lumière blanche se dispersent en sept bandes de couleurs. Ces bandes de couleur sont appelées spectre. Sept couleurs constituent la lumière blanche: rouge, orange, jaune, vert, bleu, indigo et violet. Dans tout spectre, les bandes de couleur sont toujours organisées dans cet ordre de gauche à droite.

Supposons que nous projetions un faisceau de lumière blanche sur une substance absorbant la lumière bleue. Comme la composante bleue de la lumière blanche est absorbée par la substance, la lumière transmise est principalement jaune, la couleur complémentaire du bleu. Cette lumière jaune atteint nos yeux et nous «voyons» la substance comme une substance de couleur jaune.

La variation de couleur d’un système qui subit un changement de concentration de certains composants constitue la base de l’analyse colorimétrique.

 

Analyse colorimétrique

 

Qu’est-ce que la colorimétrie?

La colorimétrie est simplement la mesure de la couleur. La colorimétrie est la détermination de la concentration d’une substance en mesurant l’absorption relative de la lumière par rapport à une concentration connue de la substance. En colorimétrie visuelle, la lumière blanche naturelle ou artificielle est généralement utilisée comme source de lumière et les déterminations sont généralement effectuées à l’aide d’un simple instrument appelé colorimètre ou comparateur de couleur. Lorsque l’œil est remplacé par une cellule photoélectrique, l’instrument est appelé colorimètre photoélectrique.

Une analyse colorimétrique repose sur le principe selon lequel de nombreuses substances réagissent entre elles et forment une couleur qui peut indiquer la concentration de la substance à mesurer. Lorsqu’une substance est exposée à un faisceau d’intensité lumineuse (I₀), une partie du rayonnement est absorbée par les molécules de la substance et un rayonnement d’intensité (I) est émis. Cette différence d’intensité est utilisée pour la détermination colorimétrique.

La quantité de rayonnement absorbée est donnée par la loi de Beer-Lambert:

A = Ɛ · l · C

Où:

  • A est l’absorbance
  • Ɛ est le coefficient d’extinction molaire [L/(mol·cm)]
  • l est la longueur du chemin (cm)
  • C est la concentration (mol / litre)

Photomètre vs spectrophotomètre

 

photomètre

Un photomètre isole une longueur d’onde spécifique de la lumière à l’aide de filtres. Un colorimètre utilise des filtres de bande de contour, ou un système similaire, pour séparer la lumière en composantes de couleur, puis les adapte aux courbes correspondantes basées sur l’œil humain, afin de produire des valeurs de couleur basées sur ce que l’œil humain verrait.

Ceci est idéal pour faire correspondre la réponse visuelle humaine, mais ne vous dit rien sur les données invisibles à l’œil humain, telles que les pointes émissives à des points étroits du spectre; données spectrales, et nécessite un spectrophotomètre.

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Spectrophotomètre

Les spectrophotomètres sont différents des photomètres car ils permettent de mesurer dans le spectre toutes les longueurs d’onde de la lumière visible et pas seulement les longueurs d’onde spécifiées à l’avance. Les spectrophotomètres fonctionnent en isolant la lumière à des longueurs d’onde spécifiques de la lumière blanche.

Un spectrophotomètre se divise en un spectre utilisant un réseau de couleurs ou un système similaire. Ensuite, un réseau de capteurs lit chaque section du spectre, produisant des données spectrales.

Ceci est idéal si vous analysez les émissions spectrales d’une ampoule, d’une étoile ou de toute autre source de lumière. C’est pourquoi les spectrophotomètres sont souvent utilisés comme appareils scientifiques.

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Configurations optiques d’un spectrophotomètre

Faisceau unique

Dans un spectrophotomètre à faisceau unique conventionnel, le blanc et l’échantillon sont mesurés consécutivement, avec un intervalle de plusieurs secondes pour une mesure de longueur d’onde unique et jusqu’à plusieurs minutes pour une mesure de spectre complet avec un instrument conventionnel. La dérive de la lampe peut entraîner des erreurs importantes sur de longs intervalles de temps.

Faisceau unique

Double faisceau

Le spectrophotomètre à double faisceau ou double faisceau a été développé pour compenser ces changements d’intensité de la lampe entre les mesures effectuées sur des cuvettes à blanc et à échantillon. Dans cette configuration, la source de lumière émet un seul faisceau lumineux qui est divisé par un hacheur de lumière, créant deux faisceaux d’énergie égale avec un chemin optique égal. Un faisceau traverse la référence tandis que l’autre traverse l’échantillon.

Comparés aux conceptions à faisceau unique, les instruments à faisceau double contiennent davantage de composants optiques, ce qui réduit le débit et la sensibilité. Pour une sensibilité élevée, des temps de mesure longs peuvent être nécessaires. De plus, la conception mécanique plus complexe du spectrophotomètre à double faisceau peut nuire à la fiabilité.

double faisceau

Faisceau divisé

Le spectrophotomètre à faisceau divisé ressemble au spectrophotomètre à double faisceau, mais il utilise un séparateur de faisceau au lieu d’un hacheur pour envoyer de la lumière le long des chemins de blanc et d’échantillon simultanément à deux détecteurs distincts mais identiques. Cette configuration permet de mesurer le blanc et l’échantillon en même temps. La conception à faisceau divisé est mécaniquement plus simple que le véritable instrument à double faisceau et nécessite moins d’éléments optiques.

Meilleures utilisations pour un spectrophotomètre

Les spectrophotomètres actuels sont conçus pour être à la fois durables et portables, offrant une flexibilité d’utilisation. Bien que les applications soient presque infinies, les meilleures utilisations incluent:

  • détermination élémentaire de la qualité de l’eau
  • analyse enzymatique dans le vin
  • analyse des propriétés des engrais pour l’agriculture

Ce ne sont que quelques-unes des nombreuses utilisations potentielles d’un spectrophotomètre.